细菌膜蛋白提取试剂盒

产品货号：

BTN100929

中文名称：

细菌膜蛋白提取试剂盒

英文名称：

Bacterium Membrane Protein Purification Kit

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细胞后，通过超速离心分离出细菌细胞膜和附着的蛋白质。

一步式分离细菌细胞膜和膜蛋白，密度梯度离心法简单快捷。
膜蛋白纯度高，能够去除各种胞浆蛋白的污染，也能去除松散附着在细胞膜上的蛋白，所得膜蛋白主要是整合蛋白。
膜蛋白完整性好。
回收效率高，一般能得到相当于总蛋白量6%的膜蛋白。
可用于Escherichia coli，Salmonella typhimurium，Klebsiella aerogens，Pseudomonas aeruginosa，Caulobacter crescentus等细菌。
本制品需要冷冻超速离心机。

组分	规格
细菌细胞膜蛋白纯化溶液A	125mL
细菌细胞膜蛋白纯化溶液B	25mL
细菌细胞膜蛋白纯化溶液C	250mL
DNase I干粉	3.5mg

保存：室温，其中DNase I干粉需置于-20℃保存，有效期1年。

用户自备

膜蛋白溶解液(取决于后续实验。如果后续实验为SDS-PAGE，则用1×SDS-PAGE上样液作为溶解液；如果用于2D电泳，则使用1×等电点电泳上样液作为溶解液)。

准备工作

第一次使用本试盒时要将所有DNase I干粉倒入B中，轻柔颠倒使DNase I干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一个月内完，否则DNase将逐渐失去活性。此外，最好在实验前1小时将细菌膜蛋白纯化细菌细胞膜蛋白纯化溶液C冰浴预冷。

小量制（用于上样量比较小的SDS-PAGE等实验）
1. 收集20～40mL过夜培养的细菌饱和培养液（OD420在1.5左右即可），2500g室温离心10分钟后弃上清。
2. 加入2mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，轻柔吹打，将细菌重悬于细菌细胞膜蛋白纯化溶液A中。
3. 2500g室温离心10分钟后弃上清。
4. 加入0.5mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液B（必须已经提前加入了DNase I干粉），轻柔吹打使细菌重悬。
  - 如果细菌起始量没有20～40mL，细菌细胞膜蛋白纯化溶液A的用量可以等比例降低。重悬在细菌细胞膜蛋白纯化溶液A中的细菌可以放-80℃长期保存。
5. 用超声或French Press方法裂解细胞，直到80%以上的细菌都裂解为止。
  - 如果用French Press方法，则需要处理至少两次，每次的压力为9.65×10⁷(=14000 psi)。
  - 不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程。
6. 2500g室温离心8分钟后小心转移上清到新的10mL～15mL塑料离心管中（如BeckmanOptima台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。
7. 在上清(细菌裂解液)中加入5mL预冷的细菌细胞膜蛋白纯化溶液C，轻柔颠倒混匀后冰浴放置30～60分钟。其间可以轻柔颠倒混匀3～5次。
8. 用BechmanOptima台式超速离心机在115000g，4℃下离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
9. 小心移弃上清，在沉淀中加入0.2mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，充分吹打混匀。
10. 用BeckmanOptima台式超速离心机在115000g，4℃下离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
11. 小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入0.1mL自备的，跟后续实验兼容的缓冲液(如1×SDS-PAGE上样液中，可从本公司购买)，所得膜蛋白的浓度将在1mg/mL左右。
大量制备（要用于上样量比较的2D电等实验）
1. 收集200～400mL过夜培养的细菌饱和培养液(OD420在1.5左右即可)，2500g室温离心10分钟后弃上清。
2. 加入20mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，轻柔吹打，将细菌重悬于细菌细胞膜蛋白纯化溶液A中。
3. 2500g室温离心10分钟后弃上清。
4. 加入5mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液B（必须已经提前加入了DNase I干粉），轻柔吹打使细菌重悬。
  - 如果细菌起始量没有200～400mL，细菌细胞膜蛋白纯化溶液A的用量可以等比例降低。重悬在细菌细胞膜蛋白纯化溶液A中的细菌可以放-80℃长期保存。
5. 用超声或French Press方法裂解细胞，直到80%以上的细菌都裂解为止。如果用French Press方法，则需要处理至少两次，每次的压力为9.65×10⁷(=14000 psi)。
  - 不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程。
6. 2500g室温离心8分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中，弃沉淀(未破裂细胞)。
7. 在上清（细菌裂解液）中加入50mL预冷的细菌细胞膜蛋白纯化溶液C，轻轻在冰浴中搅拌混匀30～60分钟。
  - 可以在大烧杯中装冰，然后将装有样品的小烧杯放入，在放入干净的搅拌子，以最低速度搅拌。
8. 用Beckman Type 55.2 Ti转头在115000g，4℃下离心60分钟。
  也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
9. 小心移弃上清，在沉淀中加入2mL细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，充分吹打混匀。
10. 用Beckman Type 55.2 Ti转头在115000g，4℃下离心60分钟。
  - 也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
11. 小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在1mL自备的，跟后续实验兼容的缓冲液(如1×等电点电泳上样液，可从本公司购买)，所得膜蛋白的浓度在1mg/mL左右。

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